Long-Read Sequencing for Rare Disease Diagnosis: Closing the Diagnostic Gap

Rare diseases collectively affect approximately 300-400 million people worldwide, yet obtaining a molecular diagnosis remains frustratingly difficult. Standard clinical genomics workflows rely on short-read sequencing (SRS), typically Illumina-based whole-genome or whole-exome sequencing, which reads DNA fragments of 150-300 base pairs. This technology excels at detecting single nucleotide variants and small insertions/deletions but struggles with the structural complexity that underlies many unsolved rare diseases. Two studies published in early 2025 demonstrate that long-read sequencing (LRS) can resolve cases that SRS cannot.

Why Short Reads Miss Variants

The human genome is not a simple linear sequence. It contains vast repetitive regions, segmental duplications, tandem repeat expansions, and complex structural rearrangements that cannot be reconstructed from short sequencing reads. When 150-bp fragments are mapped to a reference genome, reads originating from repetitive regions map ambiguously to multiple locations, effectively rendering these regions invisible to variant calling.

This is not a minor gap. Structural variants (SVs)—deletions, duplications, inversions, and translocations larger than 50 bp—account for more nucleotide differences between any two human genomes than single nucleotide variants do. Short tandem repeat (STR) expansions cause well-known diseases (Huntington's, Fragile X, myotonic dystrophy) and likely contribute to many unsolved cases. Additionally, some Mendelian disease genes reside in regions that SRS cannot reliably cover.

The Negi et al. Study: Nanopore Sequencing for 41 Families

Negi et al. (2025), published in the American Journal of Human Genetics, sequenced 98 samples from 41 families with suspected rare monogenic diseases using Oxford Nanopore Technology (ONT). Their Napu pipeline generated haplotype-resolved genome assemblies, phased variant calls, and methylation profiles from single flow cells achieving approximately 36x coverage with 32-kb read N50.

Key findings include:

• Coverage of previously inaccessible genes. On average, LRS covered coding exons in approximately 280 genes and 5 known Mendelian disease-associated genes that SRS could not cover. These are genes where short reads either fail to map or produce unreliable calls.

• Detection of additional rare variants. LRS detected structural variants, tandem repeat expansions, and complex rearrangements that were absent from SRS variant call sets. These include variants in clinically relevant size ranges (50 bp to several megabases) that fall in the gap between SRS-detectable indels and cytogenetically visible rearrangements.

• Comprehensive phasing. LRS completely phased 87% of protein-coding genes, enabling unambiguous determination of which variants sit on the same haplotype—critical for compound heterozygosity assessment in recessive disorders.

• Diagnostic yield. The team established diagnostic variants in 11 probands, with causes including de novo variants, compound heterozygous variants, large-scale SVs, and epigenetic modifications. The diversity of causal mechanisms underscores that LRS captures variant classes that SRS systematically misses.

The Steyaert et al. Study: HiFi Sequencing for 114 Families

Steyaert et al. (2025), published in Genome Research as part of the Solve-RD pan-European program, applied PacBio HiFi long-read sequencing at 10x coverage to 293 individuals from 114 genetically undiagnosed rare disease families. Of these, 93 families had exhausted prior testing for neurological, neuromuscular, or epilepsy disorders, and 21 families had so-called "unsolvable" syndromes.

Results were telling:

• 12 novel genetic diagnoses were established through LRS, including de novo and rare inherited SNVs, indels, SVs, and STR expansions. Among these, an MCF2/FGF13 fusion and a PSMA3 deletion were identified as candidate disease-causing variants in additional families.

• Disease-causing variants found in 11.8% of previously unsolved families, with candidate variants in another 5.4%.

• No common genetic cause was identified in the 21 "unsolvable" syndrome families, suggesting these conditions may involve non-genetic factors, extremely rare variants not yet catalogued, or complex oligogenic interactions.

The diagnostic yield of approximately 12-17% (combining definitive and candidate diagnoses) in families that had already undergone extensive prior genetic testing is significant. These are not easy cases—they represent the residuum after standard diagnostics failed.

Complementary Strengths

The two studies employ different LRS technologies with distinct characteristics:

<

Feature	ONT (Negi et al.)	HiFi (Steyaert et al.)
Read length	Ultra-long (32 kb N50)	Long (10-20 kb typical)
Base accuracy	~95-99% (single read)	>99.9% (consensus)
Methylation	Native, simultaneous	Requires separate analysis
Coverage	~36x (1 flow cell)	~10x
Cost per sample	Lower	Higher per base

ONT provides ultra-long reads and native methylation detection, enabling resolution of the most complex structural variants and direct epigenetic profiling. HiFi sequencing provides near-perfect per-read accuracy, reducing the need for high coverage and simplifying variant calling pipelines. The choice between platforms depends on the specific diagnostic question.

Critical Considerations

Cost remains a barrier. LRS is more expensive per sample than SRS, and clinical laboratories face budget constraints. The cost-effectiveness argument depends on where in the diagnostic odyssey LRS is deployed: as a first-tier test (replacing SRS) or as a second-tier test (for SRS-negative cases). Current evidence supports second-tier deployment, but declining sequencing costs may shift this calculation.

Analytical pipelines are maturing but not standardized. Unlike SRS, where GATK best practices provide a widely accepted workflow, LRS analysis lacks consensus pipelines. Different callers perform differently for different variant types, and benchmarking resources for LRS are less developed.

Interpretation challenges remain. Detecting more variants is only useful if those variants can be interpreted. Many SVs and repeat expansions identified by LRS are novel—absent from existing databases—making pathogenicity assessment difficult.

The unsolvable remain unsolved. The 21 "unsolvable" syndrome families in Steyaert et al. yielded no common genetic cause despite LRS, reminding us that sequencing technology alone cannot solve all rare diseases.

Open Questions

• What is the optimal clinical pathway for integrating LRS into rare disease diagnostics—first-tier, second-tier, or triggered by specific phenotypic indicators?
• Can LRS diagnostic yields improve with higher coverage, or are the remaining unsolved cases fundamentally different in nature?
• How should clinical laboratories validate and report novel structural variants detected by LRS when database evidence is lacking?
• Will adaptive sampling—the ability to selectively sequence regions of interest in real time on nanopore platforms—provide a cost-effective compromise between whole-genome LRS and targeted panels?

Closing Reflection

The rare disease diagnostic gap is not primarily a knowledge gap—it is a resolution gap. Standard sequencing reads are too short to capture the full spectrum of human genetic variation. These two studies, from complementary technological perspectives, demonstrate that long-read sequencing resolves a meaningful fraction of previously intractable cases. For families enduring years-long diagnostic odysseys, a 12-17% solve rate from a single additional test represents genuine clinical impact. As costs decrease and analytical methods mature, LRS is positioned to become a standard component of the rare disease diagnostic toolkit.

---

희귀 질환은 전 세계적으로 약 3억~4억 명에게 영향을 미치지만, 분자 진단을 받는 것은 여전히 매우 어려운 일이다. 표준 임상 유전체학 워크플로우는 단독해 시퀀싱(SRS, short-read sequencing)에 의존하며, 이는 일반적으로 Illumina 기반의 전장 유전체 시퀀싱 또는 전장 엑솜 시퀀싱으로, DNA 단편을 150~300 염기쌍 단위로 읽는다. 이 기술은 단일 뉴클레오타이드 변이 및 소규모 삽입/결실 검출에는 탁월하지만, 많은 미해결 희귀 질환의 근저에 있는 구조적 복잡성을 다루는 데에는 한계가 있다. 2025년 초에 발표된 두 연구는 장독해 시퀀싱(LRS, long-read sequencing)이 SRS로는 해결하지 못한 사례들을 해결할 수 있음을 보여준다.

단독해 시퀀싱이 변이를 놓치는 이유

인간 유전체는 단순한 선형 서열이 아니다. 유전체에는 방대한 반복 영역, 분절 중복, 직렬 반복 확장, 그리고 단독해 시퀀싱 리드로는 재구성할 수 없는 복잡한 구조적 재배열이 존재한다. 150 bp 단편을 참조 유전체에 매핑할 때, 반복 영역에서 유래한 리드는 여러 위치에 모호하게 매핑되어 이러한 영역이 변이 검출 과정에서 사실상 불가시적인 상태가 된다.

이것은 사소한 공백이 아니다. 구조적 변이(SV, structural variant)—50 bp 이상의 결실, 중복, 역위, 전좌—는 임의의 두 인간 유전체 간에 단일 뉴클레오타이드 변이보다 더 많은 뉴클레오타이드 차이를 야기한다. 단독 직렬 반복(STR, short tandem repeat) 확장은 잘 알려진 질환(헌팅턴병, 취약 X 증후군, 근긴장성 이영양증)을 유발하며, 미해결 사례 다수에도 기여할 가능성이 있다. 또한 일부 멘델 유전 질환 유전자는 SRS로 신뢰성 있게 커버할 수 없는 영역에 위치한다.

Negi 등의 연구: 41개 가계에 대한 나노포어 시퀀싱

Negi et al. (2025)은 American Journal of Human Genetics에 발표된 연구에서, 단일 유전자 희귀 질환이 의심되는 41개 가계의 98개 샘플을 Oxford Nanopore Technology(ONT)를 이용해 시퀀싱하였다. 연구팀의 Napu 파이프라인은 약 36x 커버리지와 32 kb 리드 N50을 달성한 단일 플로우 셀로부터 일배체형 분해 유전체 어셈블리, 페이징된 변이 검출 결과, 그리고 메틸화 프로파일을 생성하였다.

주요 결과는 다음과 같다:

• 기존에 접근 불가능했던 유전자의 커버리지. 평균적으로 LRS는 SRS가 커버하지 못한 약 280개 유전자의 코딩 엑손과 5개의 알려진 멘델 유전 질환 관련 유전자를 커버하였다. 이는 단독해 리드가 매핑에 실패하거나 신뢰할 수 없는 검출 결과를 내는 유전자들이다.

• 추가적인 희귀 변이 검출. LRS는 SRS 변이 검출 집합에는 없었던 구조적 변이, 직렬 반복 확장, 복잡한 재배열을 검출하였다. 여기에는 SRS로 검출 가능한 소삽입결실과 세포유전학적으로 가시적인 재배열 사이의 공백에 해당하는, 임상적으로 유의미한 크기 범위(50 bp~수 메가베이스)의 변이가 포함된다.

• 포괄적 페이징. LRS는 단백질 코딩 유전자의 87%를 완전히 페이징하여, 어떤 변이가 동일한 일배체형에 위치하는지 명확하게 결정할 수 있었다—이는 열성 질환에서 복합 이형접합성 평가에 결정적이다.

• 진단 수율. 연구팀은 11명의 발단자에서 진단 변이를 확정하였으며, 원인으로는 드노보 변이, 복합 이형접합 변이, 대규모 SV, 그리고 후성유전학적 변형이 포함되었다. 원인 기전의 다양성은 LRS가 SRS가 체계적으로 놓치는 변이 유형들을 포착함을 뒷받침한다.

Steyaert 등의 연구: 114개 가계에 대한 HiFi 시퀀싱

Steyaert et al. (2025)은 Solve-RD 범유럽 프로그램의 일환으로 Genome Research에 발표된 연구에서, 유전적으로 미진단된 희귀 질환 114개 가계의 293명에게 10x 커버리지로 PacBio HiFi 장독해 시퀀싱을 적용하였다. 이 중 93개 가계는 신경계, 신경근, 또는 뇌전증 질환에 대한 이전 검사를 모두 소진한 상태였으며, 21개 가계는 소위 "해결 불가능한" 증후군으로 분류된 상태였다.

결과는 다음과 같이 나타났다:

• LRS를 통해 12건의 신규 유전 진단이 확립되었으며, 여기에는 de novo 및 희귀 유전성 SNV, indel, SV, STR 확장이 포함된다. 이 중 MCF2/FGF13 융합과 PSMA3 결실이 추가 가계에서 질환 원인 후보 변이로 확인되었다.

• 질환 원인 변이는 기존에 해결되지 않은 가계의 11.8%에서 발견되었으며, 또 다른 5.4%에서는 후보 변이가 확인되었다.

• 공통 유전 원인은 확인되지 않았다. 21개의 "해결 불가" 증후군 가계에서 공통 유전 원인이 확인되지 않았으며, 이는 해당 질환들이 비유전적 요인, 아직 목록화되지 않은 극히 희귀한 변이, 또는 복잡한 oligogenic 상호작용을 수반할 수 있음을 시사한다.

광범위한 사전 유전 검사를 이미 받은 가계에서 확정적 진단과 후보 진단을 합산한 약 12~17%의 진단율은 주목할 만하다. 이들은 결코 단순한 사례가 아니며, 표준 진단이 실패한 후 남은 잔여 사례들을 대표한다.

상호 보완적 강점

두 연구는 서로 다른 특성을 지닌 상이한 LRS 기술을 활용한다.

<

특성	ONT (Negi et al.)	HiFi (Steyaert et al.)
리드 길이	초장형 (32 kb N50)	장형 (일반적으로 10-20 kb)
염기 정확도	~95-99% (단일 리드)	>99.9% (컨센서스)
메틸화	네이티브, 동시 분석	별도 분석 필요
커버리지	~36x (1 flow cell)	~10x
샘플당 비용	낮음	염기당 비용 높음

ONT는 초장형 리드와 네이티브 메틸화 검출을 제공하여, 가장 복잡한 구조 변이의 해석과 직접적인 후성유전학적 프로파일링을 가능하게 한다. HiFi 시퀀싱은 리드당 거의 완벽한 정확도를 제공하여 높은 커버리지의 필요성을 줄이고 변이 호출 파이프라인을 단순화한다. 플랫폼 선택은 특정 진단 목적에 따라 달라진다.

주요 고려 사항

비용은 여전히 장벽으로 작용한다. LRS는 SRS에 비해 샘플당 비용이 높으며, 임상 실험실은 예산 제약에 직면해 있다. 비용 효율성 논거는 LRS가 진단 과정의 어느 단계에 적용되느냐에 달려 있다. 즉, 일차 검사(SRS를 대체)로 사용하느냐, 아니면 이차 검사(SRS 음성 사례에 적용)로 사용하느냐에 따라 달라진다. 현재 근거는 이차 적용을 지지하지만, 시퀀싱 비용 감소로 인해 이러한 계산이 달라질 수 있다.

분석 파이프라인은 성숙해가고 있으나 표준화되어 있지 않다. GATK 모범 사례가 널리 수용되는 워크플로를 제공하는 SRS와 달리, LRS 분석에는 합의된 파이프라인이 부재하다. 변이 유형에 따라 호출 도구의 성능이 상이하며, LRS에 대한 벤치마킹 리소스도 충분히 개발되어 있지 않다.

해석 과제는 여전히 남아 있다. 더 많은 변이를 검출하는 것은 해당 변이를 해석할 수 있을 때에만 유용하다. LRS로 확인된 SV 및 반복 확장의 상당수는 신규 변이로, 기존 데이터베이스에 존재하지 않아 병원성 평가가 어렵다.

해결 불가 사례는 여전히 미해결로 남는다. Steyaert et al.의 21개 "해결 불가" 증후군 가계에서는 LRS에도 불구하고 공통 유전 원인이 확인되지 않았으며, 이는 시퀀싱 기술만으로는 모든 희귀 질환을 해결할 수 없음을 상기시켜 준다.

미해결 질문

• LRS를 희귀 질환 진단에 통합하기 위한 최적의 임상 경로는 무엇인가—일차 검사, 이차 검사, 또는 특정 표현형 지표에 의해 촉발되는 검사 중 어떤 것인가?
• LRS의 진단율은 더 높은 커버리지로 향상될 수 있는가, 아니면 남은 미해결 사례들은 근본적으로 다른 성격을 지니는가?
• 데이터베이스 근거가 부족한 경우, 임상 실험실은 LRS로 검출된 신규 구조 변이를 어떻게 검증하고 보고해야 하는가?
• 나노포어 플랫폼에서 실시간으로 관심 영역을 선택적으로 시퀀싱하는 adaptive sampling이 전체 게놈 LRS와 표적 패널 사이의 비용 효율적인 절충안을 제공할 수 있는가?

마치며

희귀 질환 진단 격차는 주로 지식의 격차가 아니라 해상도의 격차이다. 표준 시퀀싱 리드는 인간 유전적 변이의 전체 스펙트럼을 포착하기에 너무 짧다. 상호 보완적인 기술적 관점에서 수행된 이 두 연구는 장독취 시퀀싱이 기존에 다루기 어려웠던 사례들 중 의미 있는 비율을 해결한다는 것을 입증한다. 수년간의 진단 여정을 견뎌온 가족들에게 있어, 단일 추가 검사에서 12~17%의 해결률은 실질적인 임상적 영향을 의미한다. 비용이 감소하고 분석 방법이 성숙해짐에 따라, LRS는 희귀 질환 진단 도구 키트의 표준 구성 요소로 자리잡을 것으로 예상된다.

---